Оптимизация метода расчета структуры пептидов

УДК 577.322.53;531.395 Ускоренная публикация ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА РАСЧЕТА СТРУКТУРЫ ПЕПТИДОВ В РАСТВОРЕ ПО ДАННЫМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР © 2010 г. 1 , 1 , 2, 3 , 4 * 1 Химический факультет Московского государственного университета им. , Москва, 119991 2 Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. Российской академии медицинских наук, Москва, 119121 3 Институт молекулярной биологии им. Российской академии наук, Москва, 119991 4 Центр магнитной томографии и спектроскопии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета им. , Москва,119991 Поступила в редакцию и принята к печати 29.06.2010 г. Представлена академиком Спектроскопия ЯМР получила признание в качестве метода определения структуры белков в растворе. Однако определение конформации небольших пептидов, претерпевающих быстрые молекулярные движения, остается сложной задачей. В значительной степени это обусловлено невозможностью определения из спектров ЯМР требуемого количества ограничений на межъядерные расстояния и диэдральные углы. Вместе с тем, короткие заряженные пептиды играют важную роль в ряде биологических процессов, в частности, в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера. В этой связи актуальна разработка метода расчета структуры небольших пептидов в водном окружении с использованием наиболее реалистичных силовых полей. Такой алгоритм разработан на базе силового поля AMBER-03 и пакета молекулярной динамики Gromacs после модификации его программного кода. Алгоритм расчета проверен на модельном пептиде, для которого известна структура в растворе, и на металлсвязывающем фрагменте ?-амилоида крысы, структура которого определена альтернативными методами расчета на основании собственных экспериментальных данных. Разработанный алгоритм позволяет существенно повысить качество структур, в частности, улучшить статистику карты Рамачандрана и уменьшить среднеквадратичное отклонение координат атомов внутри семейства конформеров. Описанный протокол может быть использован при расчете структуры коротких пептидов, а также для оптимизации структуры более крупных белков, содержащих неструктурированные фрагменты. Ключевые слова: спектроскопия ЯМР, молекулярная динамика, структура пептидов, бета-амилоид, болезнь Альцгеймера. OPTIMIZATION OF THE METHODS FOR SMALL PEPTIDE SOLUTION STRUCTURE DETERMINA- TION BY NMR SPECTROSCOPY, by A. N. Istrate 1 , A. B. Mantsyzov 1 , S. A. Kozin 2, 3 , V. I. Polshakov 4 * ( 1 Chemical Department, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia; 2 Research Institute for Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 119121 Russia; 3 Engelhardt Institute of Molecular Biology, Rus- sian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 4 Center for Magnetic Tomography and Spectroscopy, Depart- ment of Fundamental Medicine, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: ). NMR spectroscopy was recognized as a method of protein structure determination in solution. However, determina- tion of the conformation of small peptides, which undergo fast molecular motions, remains a challenge. This is mainly caused by impossibility to collect required quantity of the distance and dihedral angle restraints from NMR spectra. At the same time, short charged peptides play an important role in a number of biological processes, in particular in patho- genesis of neurodegenerative diseases including Alzheimer?s disease. Therefore development of a method for structure calculation of small peptides in a water environment using the most realistic force fields seems to be of current impor- tance. Such algorithm has been developed using the Amber-03 force field and software package Gromacs after updat- ing its program code. The algorithm of calculation has been verified on a model peptide for which the solution structure is known, and on the metal binding fragment of rat ?-amyloid for which structure has been determined by alternative methods. The developed algorithm substantially increases quality of structures, in particular Ramachandran plot sta- tistics, and decreases RMSD of coordinates of atoms inside calculated family. The described protocol of calculation can be used for determination of conformation of short peptides, and also for structure optimization of larger proteins containing poorly structured fragments. Keywords: NMR spectroscopy, molecular dynamics, peptide structure, ?-amyloid, Alzheimer disease. Принятые сокращения. А? – бета-амилоид болезни Альцгеймера; RatA? (1–16) – N-концевой металлсвязывающий фрагмент ?-амилоида крысы; DQF-COSY – корелляционная спектроскопия с двухквантовой фильтрацией когерентности; TOCSY – двумерная корреляционная спектроскопия с эстафетной передачей намагниченности по спиновой системе; NOESY – двумерная спектроскопия на базе детектирования ЯЭО; ЯЭО – ядерный эффект Оверхаузера; HSQC – гетероядерная корреляционная спектроскопия с одноквантовым переносом когерентности; AMBER – используемое для расчета структуры биомолекул силовое поле, описывающее валентные и невалентные взаимодействия атомов; СКО – среднее квадратичное отклонение; а.о. – аминокислотный остаток. * Эл. почта: Многие нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера, Паркинсона и заболевания прионной природы, связаны с процессами агрегации сравнительно небольших полипептидов . Установление структурных деталей процессов, определяющих переход от непатогенных растворимых пептидов к устойчивым к протеолизу белковым агрегатам, представляет несомненный интерес как для понимания молекулярного механизма развития заболеваний данного вида, так и для разработки методов их профилактики и лечения. В возникновении и развитии болезни Альцгеймера ключевая роль принадлежит бета-амилоиду (A?) , состоящему из 39–43 аминокислот и образующемуся при действии специфических протеаз из трансмембранного белка – предшественника . A? – нормальный компонент биологических жидкостей (кровь, спинномозговая жидкость), где присутствует в сравнительно низких концентрациях (около 5–20 нМ), которые приблизительно одинаковы и для больных и для здоровых людей . Согласно широко принятой амилоидной гипотезе, ключевым молекулярным событием, приводящим к возникновению БА, является конформационное превращение растворимого мономерного А? вначале в нейротоксичные димерные и олигомерные формы, а затем и в нерастворимые фибриллярные полимерные агрегаты, которые при дальнейшим их накоплении формируют амилоидные бляшки . Пространственная структура модельных фибрилл А? недавно установлена методом ЯМР твердого тела . В частности, показано, что два разных участка молекулы А? играют существенно различающиеся роли в структуре фибрилл. Более крупный C-концевой фрагмент (с 18 по 40–42 а.о.) образует ?-лист, состоящий из двух антипараллельных тяжей, формирующих гиброфобную ?-листовую структуру при взаимодействии ?-слоев соседних молекул. N-концевой фрагмент А? (с 1 по 17 а.о.) расположен на поверхности полимерного агрегата и не участвует в образовании гидрофобного ядра фибриллы. Тем не менее, отсутствие этого фрагмента полностью блокирует фибриллогенез in vivo, что указывает на его ключевую роль в процессах формирования амилоидных бляшек. Ранее установлено, что N-концевой (а.о. 1–16) фрагмент А? является металлсвязывающим доменом , с которым связываются ионы цинка и некоторых других металлов . Следует отметить, что амилоидные бляшки действительно характеризуются повышенным содержанием двухвалентных металлов, в частности, цинка (до 1 мМ) . В недавнем теоретическом исследовании показано, что конформация N-концевого металлсвязывающего домена и возможность межмолекулярной координации ионов цинка – движущие силы процессов агрегации А? человека. А? обнаружен у всех млекопитающих, однако, интересно отметить тот факт, что у крыс отсутствуют процессы его агрегации , хотя аминокислотные последовательности пептида человека и крысы различаются всего тремя заменами, причем именно в металлсвязывающем домене. Очевидно, что установление структуры металлсвязывающего домена А? крысы актуально для определения молекулярной природы возникновения болезни Альцгеймера. Ввиду невозможности получить монокристаллы А? и их комплексов с ионами металлов, единственным методом получения структурной информации об исследуемых объектах является спектроскопия ЯМР. Определение структуры глобулярных белков методом ЯМР – сложная, но сравнительно хорошо решаемая задача . При расчете структуры белка используют методы поиска минимума энергии молекулярной системы, основанные на молекулярной динамике и алгоритме «моделированного отжига» . При этом для расчета используют силовые поля, не учитывающие электростатические взаимодействия, во всяком случае, на этапах молекулярной динамики при высокой температуре. Это обусловлено тем, что энергия электростатических взаимодействий часто приводит к нестабильности системы в процессе расчета. Более сложная задача – определение структуры небольших, конформационно подвижных пептидов. В этом случае число экспериментально определенных ограничений на межатомные расстояния и диэдральные углы обычно сравнительно невелико, и для получения надежных структурных данных в расчете необходимо учитывать электростатические взаимодействия между заряженными группами пептида. В арсенале экспериментаторов имеется ряд программных пакетов для расчета структур биомолекул по данным ЯМР. Программные пакеты CNS и X- PLOR/NIH широко используются для расчета структур без использования потенциала электростатических взаимодействий. Модификация программы СNS с модулем ARIA для автоматического отнесения сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯОЭ) предполагает совместное использование двух методов: расчет структуры биомолекулы в вакууме с помощью стандартного протокола CNS и последующая оптимизация полученных структур с помощью расчета короткой траектории в водном окружении, что предполагает использование потенциала электростатических взаимодействий на последних этапах расчета. В этом случае используется модель, так называемого, тонкого слоя растворителя. Стабильность траектории при введении зарядов в молекулу обеспечивается за счет низкой температуры молекулярной динамики и использовании структуры биомолекулы, уже сформированной в первом приближении в процессе моделированного отжига в вакууме. Программа CYANA позволяет проводить расчет структуры белка в пространстве внутренних координат (торсионных углов) без учета потенциала электростатических взаимодействий. Программный пакет ICMD использует силовое поле АМВЕR и также работает в пространстве торсионных углов в вакууме, однако, включает модельный потенциал зарядовых взаимодействий с первого этапа расчета. При этом проблему, связанную с нестабильностью траектории при введении такого потенциала, решают путем масштабирования весов экспериментальных ограничений ЯМР в течение высокотемпературной стадии МД. В последнее время все чаще потенциал электростатических взаимодействий вводят в расчет структуры белка на завершающей стадии, после окончания этапа моделированного отжига . Однако авторам не известны алгоритмы, позволяющие проводить весь процесс расчета биомолекулы в декартовых координатах в водном окружении с представлением молекул воды в явном виде. Такой алгоритм мог бы дать наиболее реалистичные результаты, хотя он и требует значительных вычислительных затрат. Перспективно для реализации такого алгоритма использование программного пакета Gromacs , имеющего открытый код. В настоящей работе проведена модификация этой программы и разработан алгоритм, позволяющий проводить расчет структуры небольших пептидов в водном окружении в декартовых координатах с использованием потенциала электростатических взаимодействий с первых этапов расчета. Протокол расчета проверен на модельном пептиде и использован для расчета структуры металлсвязывающего домена А? крысы. Проведено сравнение полученных структур с аналогичными структурами, рассчитанными с помощью стандартных протоколов, реализуемых программой CNS. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ЯМР. Синтетический полипептид DAEFGHDS- GFEVRHQK, идентичный N-концевому фрагменту А? крысы (RatA? (1–16) ) приобретен в компании Bio- peptide Co., LLC (США). Использовали 5 мM раствор RatA? (1–16) в буферном растворе 20 мM Трис-D 11 при pH 6.5, содержащем 0.1%-ный азид натрия NaN 3 для предотвращения биодеградации пептида. Спектры ЯМР измеряли при 5°С в D 2 O или 90% H 2 O/10% D 2 O на спектрометре Bruker AVANCE (Германия) с рабочей частотой 600 МГц на ядрах 1 H, оснащенном датчиком, поддерживающим одновременное резонансное возбуждение ядер 1 H, 13 C и 15 N и импульсные градиенты магнитного поля по оси z. Для отнесения сигналов пептида измерены 2D- спектры DQF-COSY, TOCSY (время смешения 70 мс), NOESY (время смешения 200 и 500 мс) и спектры гетероядерной корреляции 13 C- 1 H HSQC и 15 N- 1 H HSQC, измеренные при естественном содержании изотопов 13 C и 15 N. Отнесение сигналов выполнено в соответствии с классической методикой К. Вютриха , дополненной анализом спектров HSQC. Выполнено практически полное отнесение сигналов 1 H, сигналов 13 С боковых цепей аминокислотных остатков и сигналов 15 N амидных фрагментов полипептидной цепи. Последующий анализ спектров NOESY позволил определить 111 ограничений на межъядерные расстояния, использованных для расчета структуры пептида в растворе. Детали отнесения спектров ЯМР и сравнительный анализ полученной структурной информации – предмет отдельной публикации. Оптимизацию протокола моделированного отжига в программном пакете Gromacs проводил